肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病。人们逐渐认识到肿瘤的生成是细胞增殖和凋亡平衡失调的结果。细胞周期失控导致细胞过度增殖，但更重要的是细胞凋亡受阻，直接导致了衰老、受损及异常细胞的生命延长。因此，通过诱导肿瘤细胞凋亡来消除肿瘤也是一种应该考虑的新的治疗方法。胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，预后差，生存率低，进展期胃癌5年存活率仅15%-25%[12]。槲皮素(quercetin)作为一种具有广泛生理作用的天然生物黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜和水果中，具有抗感染、抗变态反应、扩血管和抑制血小板凝集等功能。近年来，槲皮素潜在的肿瘤预防和治疗作用日益受到关注。为了证实槲皮素的抗癌效应和探讨其作用机制，我们观察了槲皮素对胃癌细胞SGC7901生长及对热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)蛋白表达的影响，以揭示其抑制SGC7901生长的机制。
1 材料与方法
1.1 材料 槲皮素为Sigma公司产品，将其用二甲基亚砜溶解(小于250g/L)后-20℃保存备用。用前加RPMI1640稀释至使用浓度。HSP70单抗和EGFR多抗购于中山生物工程公司。
1.2 细胞培养及处理 人胃癌细胞株SGC7901引种于重庆医科大学病理生理学教研室,培养于含10%(体积分数)小牛血清、100u/mL链霉素、100μg/mL青霉素和pH 7.2的PRMI1640液中，培养条件为37℃饱和湿度、体积分数为5% CO2孵箱中，1-3d换液一次，癌细胞为贴壁生长。取对数生长期细胞，调浓度为5×104个/mL，接种于培养瓶，进行试验。将槲皮素以5、10、20、40、80μmol/L的终浓度加入培养液中，同时设不加药的细胞培养液为对照组。
1.3 台盼蓝拒染试验 不同浓度槲皮素处理的细胞分别于24、48、72、96h经4g/L台盼蓝染液染色后用血球计数仪于光镜下计数，死细胞被染成蓝色，活细胞则不被染色，计数活细胞。
细胞抑制率(%)=[1-(实验组活细胞数/对照组活细胞数)]×100%
1.4 电子显微镜观察细胞凋亡情况 取对数生长期的胃癌细胞用1g/L的胰酶消化后调成1×106细胞浓度，PBS洗涤2遍，3%(体积分数)戊二醛固定4h，质量浓度为10g/L锇酸后固定1h，体积分数为50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，LKBNOVa切片，厚度500Nm，醋酸铀、枸橼酸铅双染色法染色，电镜下观察。
1.5 流式细胞仪观察细胞周期 以10μmol/L、20μmol/L的槲皮素处理细胞48h后，收集细胞制成单细胞悬液，PBS洗两次，制备的单细胞悬液，用70%(体积分数)冰乙醇固定。染色前用PBS进行离心沉淀，去除乙醇，加10g/L RNA酶的TrisHCl缓冲液(pH 7.4)120μL-200μL 37℃水浴30min，至4℃避光保存30min，再加入50μL碘化丙锭 (propidium iodide, PI)染色液混匀进行DNA染色，4℃避光30min。通过流式细胞仪FACScan测定细胞周期分布。设未处理的细胞为空白对照。
1.6 免疫组化检测HSP70和EGFR的表达 实验操作按SP试剂盒说明书进行，EGFR工作浓度为1∶100，HSP70为即用型工作液，用PBS代替一抗作空白对照。
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